A hidrólise da sacarose através da invertase [EC.3.2.1.26] gera xarope de açúcar invertido, que é usado principalmente como ingrediente na indústria alimentícia. Para ter-se uma hidrólise satisfatória, a enzima deve ser reaproveitada após a reação. É desejável que sua atividade seja mantida constante durante um período considerável de reação. A hidrólise da sacarose foi realizada em um reator com membrana (RM) - que é um reator continuamente agitado acoplado a uma membrana de ultrafiltração (MUF) -, porque apresenta efeitos mínimos de difusão e elevada atividade por unidade de volume. O corte molecular da MUF utilizada para reter a invertase solúvel dentro do MR foi de até 100kDa. Como a invertase é o elemento principal deste processo, este trabalho foi focado no papel do corte molecular da MUF na sua atividade. O corte molecular e a natureza química da membrana-UF mostraram afetar a atividade específica da invertase.

Sucrose hydrolysis by invertase [EC.3.2.1.26] produces inverted sugar syrup, an ingredient mainly used in the food industry. To properly catalyze hydrolysis, the enzyme should be reused after this reaction. It is advisable to maintain constant activity over a considerable period. Thus, sucrose hydrolysis was performed in a membrane bioreactor - a continuously stirred tank reactor coupled with an ultrafiltration membrane (UFM) which provides good diffusion and high activity per unit volume. Molecular weight cut-off for soluble invertase UFMs was up to 100kDa. This study focused on the role of UFM invertase cut-off as it is the main element in the process. We demonstrated that both the cut-off and chemical nature of the UFM affected specific invertase activity.

Neste trabalho estudou-se a conversão da sacarose em frutose e ácido glicônico, usando as enzimas invertase, glicose oxidase e catalase, através do emprego de processo descontínuo (com adição sequencial ou simultânea das enzimas) e contínuo (adição simultânea das enzimas em reator com membrana acoplado à membrana de ultrafiltração de 100 kDa). Os parâmetros variados foram: a concentração das enzimas, a concentração inicial dos substratos (sacarose e glicose), o pH, a temperatura e a vazão específica de alimentação (processo contínuo). Obteve-se rendimento de 100%, quando a conversão foi conduzida por processo descontínuo em pH 4,5 e a 37 ºC com adição seqüencial das enzimas invertase (14,3 U), glicose oxidase (10.000 U) e catalase (59.000 U).

Conversion of sucrose into fructose and gluconic acid using invertase, glucose oxidase and catalase was studied by discontinuous (sequential or simultaneous addition of the enzymes) and continuous (simultaneous addition of the enzymes in a 100 kDa-ultrafiltration membrane reactor) processes. The following parameters were varied: concentration of enzymes, initial concentration of substrates (sucrose and glucose), pH, temperature and feeding rate (for continuous process). The highest yield of conversion (100%) was attained through the discontinuous (batch) process carried out at pH 4.5 and 37 ºC by the sequential addition of invertase (14.3 U), glucose oxidase (10,000 U) and catalase (59,000 U).

Invertase, na forma adsorvida ou não em copolímeros de estireno-divinilbenzeno, foi usada para a hidrólise contínua de sacarose utilizando um reator com membrana (RM), acoplado a uma membrana de ultrafiltração (UF-100kDa), ou de microfiltração (MF - um diâmetro de poro de 5µm). Em todos os testes, o pH (5,5), a temperatura (30ºC), o volume reacional (10mL) e a agitação (100 rpm) foram mantidas constantes; os parâmetros variados foram: a vazão de alimentação (0,4; 0,8 e 1,6 h-1), a concentração de sacarose alimentada (2,5; 6,5; 50 e 100 mM) e a relação enzima/resina (1,64 mg ou 3,28 mg de proteína por 25, 50 ou 100 mg de resina). O melhor resultado (um rendimento de 100%, um período de estado estacionário acima de 20h e uma taxa de reação específica maior de 243 x 10-3 mmol/h.mE) foi obtido quando a invertase insolúvel (1,64 mg de proteína/100 de mg resina) foi usado para converter 50 mM ou 100 mM de solução de sacarose a 0,4 h-1 usando UF-RM.

Invertase, whether adsorbed on styrene-divinylbenzene copolymers or otherwise, was used for continuous sucrose hydrolysis using a cell-type membrane reactor (CTMR), coupled with an ultra (UF-100kDa), or a microfiltration (MF- pore diameter of 5 µm) membrane. In all tests, the pH (5.5), temperature (30 ºC), reaction volume (10 mL) and agitation (100 rpm) were set constant; whereas, variable parameters were: feeding rate (0.4, 0.8 and 1.6 h-1), inlet sucrose concentration (2.5, 6.5, 50 and 100 mM) and enzyme/resin ratio (1.64 mg or 3.28 mg of protein per 25, 50 or 100 mg of resin). The best result (yield of 100%, steady-state duration over 20h and specific reaction rate over 243 x 10-3 mmol/h.mE) was obtained when insoluble invertase (1.64 mg protein/100 mg resin) was used to convert 50 mM or 100 mM of sucrose solution at 0.4 h-1 using a UF-CTMR.

A bioconversão enzimática da xilose em xilitol pela xilose redutase (XR) é uma alternativa para as vias química e microbiológica. Avaliouse a purificação parcial da XR, utilizando os três seguintes procedimentos: uma coluna de agarose, um reator com membrana ou tubos de ultracentrifugação Amicon Ultra-15 50K, com rendimento de 40%, 7% ou 67%, respectivamente.

The enzymatic bioconversion of xylose into xylitol by xylose reductase (XR) is an alternative for chemical and microbiological processes. The partial purified XR was obtained by using the following three procedures: an agarose column, a membrane reactor or an Amicon Ultra-15 50K Centrifugal Filter device at yields of 40%, 7% and 67%, respectively.

Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é uma importante enzima usada em estudos bioquímicos e médicos, bem como em diversos métodos analíticos com aplicação comercial e industrial. Neste trabalho foi avaliado a extração da G6PDH em sistemas de duas fases aquosas (ATPS) constituídos por poli(etilenoglicol) (PEG)/tampão fosfato, usando como fonte de enzima um meio preparado por rompimento de leveduras de panificação comercial. Inicialmente foram investigados os efeitos da massa molar do PEG na partição da enzima e da homogeneização e repouso no equilíbrio do sistema. Na sequência, diversos ATPS foram preparados usando análise estatística (planejamento fatorial 2²). Os resultados, incluindo parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a atividade da G6PDH, indicaram parcial purificação desta enzima em ATPS constituídos por 17,5% (p/p) PEG400 e 15,0% (p/p) fosfato. Um alto valor de recuperação enzimática (97,7%), um alto coeficiente de partição (351), e um fator de purificação aceitável (2,28 vezes maior que em homogenato celular) foram obtidos na fase superior do sistema. Assim, foi possível alcançar uma pré-purificação eficaz da enzima separando alguns contaminadores aplicando um método simples tal como a extração líquido-líquido em sistemas bifásicos (ATPS).

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is an important enzyme used in biochemical and medical studies and in several analytical methods that have industrial and commercial application. This work evaluated the extraction of G6PDH in aqueous two-phase system (ATPS) of poly(ethyleneglycol) (PEG)/phosphate buffer, using as enzyme source a medium prepared through commercial baker's yeast disruption. Firstly, the effects of PEG molar mass on the enzyme partition and of homogenization and rest on the system equilibrium were investigated. Afterwards, several ATPS were prepared using statistical analysis (2² factorial design). The results, including kinetic and thermodynamic parameters for the G6PDH activity, showed partial purification of this enzyme in ATPS composed of 17.5% (w/w) PEG400 and 15.0% (w/w) phosphate. A high enzymatic recovery value (97.7%), a high partition coefficient (351), and an acceptable purification factor (2.28 times higher than in cell homogenate) were attained from the top phase. So, it was possible to attain an effective enzyme pre-purification by separating some contaminants with a simple method such as liquid-liquid extraction in aqueous two-phase systems (ATPS).

A xilose redutase (XR) (E.C.1.1.1.21), produzida por Candida guilliermondii cultivada em hidrolisado de bagaço de cana de açúcar, foi separada diretamente do homogenato livre de células através da técnica de micelas reversas feitas com cetil trimetil brometo de amônio (CTAB). Obteve-se um rendimento de recuperação da enzima de 100% e um fator de enriquecimento de 5,6 vezes. As condições de extração foram: pH=7,0, condutividade elétrica = 14 mS/cm, T= 5 ºC, 5% (w/w) de hexanol, 22% (w/w) de butanol e 0.15M CTAB. A XR após a extração manteve-se estável no intervalo de pH entre 6.0 e 6.5, sendo a constante de inativação térmica cerca de 6,5 vezes maior do que aquela antes da extração. Os valores de Vmax da XR frente à xilose e NADPH antes e após a extração por micelas reversas diferiram cerca de 6%, enquanto que as diferenças nos valores de K M foram mais pronunciadas. O (K M)xilose para a XR após a extração foi cerca de 35% maior do que antes da extração, enquanto que (K M)NADPH foi 30% menor após do que antes da extração. As variações nos valores de K M indicam, indiretamente, que a afinidade da XR simultaneamente diminui para a xilose e aumenta para o NADPH. Este resultado poderia explicar a razão pela qual os valores de Vmax antes e após a extração terem sido praticamente iguais.

Xylosereductase (XR) (E.C.1.1.1.21), produced by Candida guilliermondii, grown in sugar cane bagasse hydrolysate, was separated directly from the cell homogenate by reversed micelles of cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB), attaining a recovery yield of 100% and enrichment factor of 5.6 fold. The extraction conditions were: pH=7.0, electrical conductivity= 14 mS/cm, T=5 ºC, 5% (w/w) of hexanol, 22% (w/w) of butanol and 0.15 M CTAB. The XR after extraction was stable in pH interval of 6.0-6.5 and its heat inactivation constant was about 6.5 fold higher than that before extraction. The Vmax values against both xylose and NADPH for XR before and after extraction by reversed-micelles differed about 6%, whereas the difference on K M values were more pronounced. The (K M)xylose for XR after extraction was about 35% higher than before extraction, meanwhile (K M)NADPH was about 30% lower after than before extraction. As the K M variations indirectly signaled, the XR affinity simultaneously diminishes for xylose and increases for NADPH. This could probably explain why the Vmax values for XR before and after extraction were quite similar.

O presente trabalho descreve um método de adsorção da invertase (EC. 3.2.1.26) na resina de troca aniônica do tipo Dowex®. Entre os tipos de resinas Dowex® estudados (1x8:50-400; 1x4:50-400 e 1x2:100-400), 1x4-200 foi a mais apropriada devido à completa adsorção das moléculas de invertase e a sua retenção de atividade catalítica de 100% do complexo 1x4-200/invertase. Salienta-se ainda a ausência do desprendimento da enzima do suporte após o término da hidrólise da sacarose.

This communication describes a method for adsorbing the invertase (EC.3.2.1.26) on DOWEX® anion exchange resin. Among the types of DOWEX® resins studied (1x8:50-400; 1x4:50-400 and 1x2:100-400), 1X4-200 was the most suitable, because it adsorbed the invertase molecules completely and the complex 1X4-200/invertase retained 100% of the catalytic activity. Moreover, no leakage of enzyme from the support was noted at the end of the sucrose hydrolysis.

Sorbitol e ácido glucônico são produzidos por células previamente cultivadas da bactéria produtora de etanol Zymomonas mobilis pela ação das enzimas periplasmáticas glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-delta-lactonase (GL). A atividade de GFOR/GL em células a serem empregadas nesta bioconversão depende das condições de crescimento. Em cultivo em regime descontínuo, com concentrações iniciais de glicose (S0) entre 42 e 230 g/L, as maiores atividades específica e total de GFOR/GL foram obtidas com S0 = 153 g/L (12,6 U/g de células e 62 U/L), enquanto maiores S0 levaram a atividades decrescentes em células não tratadas. Com S0 = 209 g/L, a atividade específica final foi de 7 U/g, mas, após a ruptura das células, atividade superior a 15 U/g foi medida. Uma vez que em descontínuo observou-se inibição por substrato com S0 a partir de 153 g/L, ensaios em regime descontínuo alimentado, com glicose equivalente a 230 g/L em descontínuo, foram realizados. Embora a inibição pelo substrato tenha sido superada, a atividade permaneceu baixa (5,2 U/g). Um novo ensaio em descontínuo alimentado, conduzido sob baixa pressão para remover o etanol do meio, resultou em atividade específica de 9,8 U/g e total de 68,7 U/L. Estes resultados indicam que as baixas atividades em células de Z. mobilis cultivadas com maiores S0 se deveram a mudanças na parede celular, provocadas por concentrações elevadas de etanol, que dificultaram o transporte de substrato para as enzimas intracelulares durante a bioconversão. Esta conclusão foi confirmada em ensaios de bioconversão com células provenientes de cultivos em diferentes condições.

Previously grown cells of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis produce sorbitol and gluconic acid, in reactions catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-delta-lactonase (GL). The GFOR/GL system activity, in cells to be used in this bioconversion, depends on growth conditions. In batch runs, with initial glucose concentrations (S0) from 42 to 230 g/L, the highest specific and total GFOR/GL activities were obtained with S0 = 153 g/L (12.6 U/g cells and 62 U/L). Higher S0 led to decreasing activities in fresh cells. With S0 = 209 g/L, the final specific activity was only 7.0 U/g. After disruption of cells, however, an activity over 15 U/g was revealed. Since growth inhibition with S0 over 153 g/L was observed in batch mode, fed-batch runs, equivalent to a batch of 230 g/L, were done. Although no growth inhibition occurred in fed-batch cultivation, enzyme activity remained low (5.2 U/g). A further fed-batch experiment, carried out under low pressure to remove ethanol from the medium, resulted in a specific activity of 9.8 U/g and a total activity of 68.7 U/L. These results indicate that the low GFOR/GL activities in Z. mobilis cells grown on higher S0 were due to changes in the cell wall, caused by high concentration of ethanol, that hindered the transport of the substrate to the intracellular enzymes in biconversion runs. This conclusion was confirmed by bioconversion runs with cells cultivated under different conditions.

Tanto em escala de laboratório como industrial, os sistemas de duas fases aquosas podem ser utilizados para a purificação, caracterização e estudos de biomateriais. Para aumentar a seletividade desse sistema, ligantes de afinidade bioespecíficos podem ser utilizados. No sistema de duas fases aquosas por afinidade, muitas enzimas podem ser purificadas. Neste artigo de revisão, a partição de algumas enzimas por esse tipo de afinidade, utilizando diferentes ligantes como corantes e íons metálicos, são discutidas. Além disso, a integração desse sistema de duas fases aquosas com outras técnicas de purificação estão sendo apresentados, com o objetivo mostrar a melhoria da eficiência do processo.

From analytical to commercial scale, aqueous two-phase systems have their application in the purification, characterization and study of biomaterials. In order to improve the selectivity of the systems, the biospecific affinity ligands were introduced. In the affinity partitioning aqueous two-phase system, have many enzymes been purified. This review discusses the partitioning of some enzymes in the affinity aqueous two-phase systems in regard to the different ligands, including reactive dyes, metal ions and other ligands. Some integration of aqueous two-phase system with other techniques for more effective purification of enzymes are also presented.

Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e hexoquinase (HK) são importantes enzimas usadas em estudos bioquímicos e médicos e em diversos métodos analíticos. Sistema de duas fases aquosas (SDFA) formado por uma solução polimérica e uma solução eletrolítica proporciona um método para separação e purificação de enzimas com diversas vantagens, incluindo biocompatibilidade, que pode ser facilmente escalonado para nível industrial. Neste trabalho, os efeitos de diferentes valores de pH na estabilidade e na partição (K, coeficiente de partição) por SDFA das enzimas G6PDH e HK, obtidas através de levedura de panificação, foram investigados. Os resultados, obtidos do sistema constituído por 17,5% de PEG 400 e 15,0% de fosfato, mostraram que com a elevação do pH de 5,0 para 8,8, o K HK aumentou 26 vezes e o K G6PDH 2,2 vezes. No sistema 20,0% PEG 1500 : 17,5% fosfato, quando o valor do pH variou de 3,8 para 8,8. os valores de K HK e K G6PDH aumentaram e 13 vezes e 1,2 vez, respectivamente. Isto permite concluir que o coeficiente de partição, para ambas as enzimas, é favorecido pela elevação do pH. Uma análise estatística dos resultados foi conduzida para confirmar esta conclusão.

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and hexokinase (HK) are important enzymes used in biochemical and medical studies and in several analytical methods. Aqueous two-phase system (ATPS) formed by a polymer solution and an electrolyte solution provides a method for the separation and purification of enzymes with several advantages, including biocompatibility and easy scale up of the process. In this work, the effects of different pH values on the storage stability and partitioning behavior (K, partition coefficient) of the enzymes G6PDH and HK from baker's yeast extract were investigated in ATPS. The results, obtained from the 17.5% PEG 400 : 15.0% phosphate system, showed that when the pH was increased from 5.0 to 8.8, the K HK increased 26-fold and the K G6PDH 2.2-fold. In the 20.0% PEG 1500 : 17.5% phosphate system, the K HK and K G6PDH increased 13 and 1.2-fold, when the pH value was increased from 3.8 to 8.8, respectively. This leads to the conclusion that the partition coefficient for both enzymes is favored by high pH values. A statistical analysis of the results was conducted to confirm this conclusion.